撰寫： 花博 來源：小張聊科研平臺的“ 課題指南針”*，*搜索“ 課題指南針”即可關注/掃描關注見文末

#國自然# #科研熱點# #課題思路#

不知道大家還記不記得我們上次給大家講解的這篇Cell（可能也已經忘了）：

原文鏈接：

整體的思路是這樣的：

但是里面還是有不少小細節值得細品。上次給大家講了體外實驗驗證分子機制部分，這次再來分析分析剩下的研究內容。（忘了上次說了什么，請戳：Cell文獻解讀丨囊括非經典自噬、外泌體的頂刊非腫瘤研究思路（上））

番外：舉一反三，由C9ORF72亞型推及到大部分ALS

如果是別的期刊文章，體外實驗做到這里就差不多了。但是Cell的文章可不行。個例→普適才是真正的臨床意義之所在。ALS在患者中有許多不同的亞型，除了文中重點關注的C9ORF72型外，還有TDP-43突變型、FUS突變型以及未見已知ALS突變位點的散發型。

于是作者挑選了8例散發性（sALS）、TDP- 43G298S、兩例FUS突變型患者來源的細胞并進行iMN誘導，重復之前的實驗，即對AP、ASO處理前后TDP-43的核/質定位、神經元死亡風險率進行了檢測，結果與之前體外實驗獲得的一致（A-G）。（詳見“Cell文獻解讀丨囊括非經典自噬、外泌體的頂刊非腫瘤研究思路（上）”）

其次，為了檢測運動神經元的功能，作者還在果蠅體內對Pikfyve進行RNAi干擾以及TDPG-43298S突變，并用AP處理后進行幼蟲翻轉實驗，結果證明降低Pikfyve和AP處理確實能提升或恢復運動神經元功能，由此完成異種體內實驗（H,I）。

體內實驗

大家可能也知道，高水平論文，尤其是頂刊級別中的動物模型，通?；蚓庉嬓∈笫菢伺洌Ｒ姷幕蚓庉嬓∈笥蠧re-Loxp系統和CRISPR/Cas9系統兩種，復雜的甚至還用到特殊品系，商品化基因編輯鼠進行二次編輯，比如常見的人源化小鼠。

這篇Cell也不例外。文中體內實驗用到的小鼠有：

Pikfyve+/+：表達Pikfyve的純合小鼠

Pikfyve+/-：Pikfyve基因敲除雜合小鼠（Cre-Loxp系統）

Pikfyve ASO：Pikfyve反義寡核苷酸抑制小鼠

TDP-43 Tg/Tg：TDP-43轉基因小鼠（TAR4/4 Thy*::TDP-43）

AAV-(GR)*00：大腦皮質細胞含GFP+/poly(GR)+的小鼠

當然還有作為對照的WT小鼠。

通過對這些小鼠的雜交，實現體內的功能挽救實驗。

*. 首先檢測對小鼠運動功能的影響

不同功能挽救用以檢測的指標類似：自噬標志物OPTN的表達、小鼠步態缺陷打分（行為學實驗）和小鼠生存期。

第一個功能挽救是在過表達TDP-43基礎上50%抑制Pikfyve（雜合突變）。結果表明抑制Pikfyve后小鼠運動功能和生存期顯著提升（A-C）。

第二個是過表達TDP-43基礎上通過ASO抑制Pikfyve，結果和上述類似，就不贅述。還有一個處理是過表達TDP-43基礎上ASO抑制Pikfyve，再使用外泌體抑制劑GW48*9，于是表型回復到過表達TDP-43水平（D-G）。

最后通過AAV-(GR)*00構建的ASO疾病模型。同時使用ASO抑制Pikfyve，結果與之前一致，小鼠運動功能和生存期都得到顯著提高（H,I）。

2. 其次檢測對小鼠疾病病理和神經再生的影響

回顧一下之前的結果，ALS神經元主要的病理特征是pTDP-43在細胞質中錯誤定位，形成斑點；而C9ORF72產生的poly(GR)+等也會異常聚集。因此，體內實驗同樣需要檢測類似病理指標的情況。

使用免疫熒光染色就能清晰看到TDP-43過表達并ASO抑制Pikfyve，以及同時使用外泌體抑制劑后小鼠脊髓神經元的形態，和TDP43的沉積情況（A-F）。

此外，神經元分泌含pTDP-43蛋白的外泌體是否會被周圍細胞攝取，從而影響周圍細胞功能也是個需要注意的問題。因此檢測了小膠質細胞中的pTDP-43斑點。結果顯示，TDP-43過表達+Pikfyve ASO小鼠的小膠質細胞確實含有更多的pTDP-43斑點，但并未影響其形態和功能（G,H,I,J）。

為了觀察抑制Pikfyve更長期的作用（因為神經退行性疾病通常與年齡有關），作者還引入了TDP-43表達量較低的TAR4小鼠并與Pikfyve+/-小鼠雜交，獲得發病時間較晚的小鼠疾病模型。

同樣檢測pTDP-43相關指標，結果表明抑制Pikfyve也能減少斑點的積累，且大腹角神經元數量回復。在AAV-(GR)*00小鼠中獲得一致結果（K-P）。

總結

到這里整篇文章的主要內容就結束了。梳理一下，文章的亮點主要有以下幾處：

*. 小分子抑制劑的提前篩選，奠定重要的臨床意義；

2. 符合邏輯的多次篩選和錯誤選項排除避免套路化，呈現創新機制；

3. 多種基因編輯小鼠品系的構建為體內完整的功能挽救實驗創造條件；

4. 除了神經元自身，還考慮到外泌體對周圍細胞的影響，設計嚴謹。

本研究還缺些什么？

人無完人，研究論文也不可能盡善盡美。盡管本文的前期篩選基礎成熟，機制分析邏輯嚴謹，實驗設計全面，但仍然有一些“GAP”并沒有填上。最重要的一個問題是：PIKFYVE抑制劑和驅動自噬內含體形成之間的直接作用始終沒有闡明。

作者在文章開頭就說明了PIKFYVE的功能是將PI3P轉化為PI(3,5)P2（磷脂酰肌醇-3,5-二磷酸），且該物質調控囊泡融合。然而，“囊泡融合”與“啟動pTDP-43周圍形成自噬內含體”仍然不是一回事。pTDP-43究竟如何被識別？又是如何受到PI(3,5)P2的影響？這些部分可能還得留到今后被解答。

02*yin.com/s/l0dNjfR4RDjvOsftz_3zyQ